Scelta di articoli
di Genetica Clinica/Umana pubblicati in Maggio
2015 nelle seguenti riviste: British
Medical Journal, Lancet, Lancet Neurology, Nature, Nature Biotechnology, Nature
Genetics, Nature Medicine, Nature Neuroscience, Nature Reviews Genetics, Nature
Reviews Neuroscience, NEJM, PNAS, Science & Cell.
ARTICOLI DA NON PERDERE
Monoallelic
expression of the human FOXP2 speech gene. PNAS 2015;112:6848. I meccanismi di espressione di un solo allele possono
avere un impatto nel neurosviluppo e nelle malattie. Possono avere una base
genetica come le CNV, le mutazione non senso, le alterazione di sequenze
regolatorie in cis che controllano il
livello, il tempo e la localizzazione di espressione, che possono essere vicine
o distanti dal promotore. Polimorfismi di regolatori in cis possono determinare anche grandi (più di 10 volte)
differenti livelli di espressione dei due alleli.
E
il silenzio trascrizionale di un allele può avvenire per effetto imprinting,
come per la s. Angelman e Prader-Willi. Un altro meccanismo epigenetico di
espressione monoallelica è l’inattivazione X. E un altro ancora, da poco
identificato e poco conosciuto, è l’espressione monoallelica autosomica casuale
(RMAE), come per l’inattivazione X, con metà delle cellule con espressione
dell’allele materno e metà paterno, con l’effetto di avere 3 diverse situazione
di espressione: ambedue gli alleli in alcune cellule, solo paterno in altre e
solo materno in altre ancora. Questo differenzia RMAE dall’inattivazione X. Esempi
noti di RAMAE sono per i geni delle immunoglobuline, dei recettori delle
cellule T e dei recettori degli odori.
Per
le malattie è intuitivo il possibile impatto di RMAE: una mutazione con perdita
di funzione di un allele causa in una data popolazione cellulare la mancata
espressione genica se quello è l’unico allele espresso, nessun effetto se viene
espresso l’allele selvatico.
In
questo articolo viene analizzato il gene FOXP2, gene vicino ma non entro i
criteri che consentono di classificarlo come gene RMAE. L’aploinsufficienza da
mutazioni in eterozigosi localizzate nel dominio forkhead FOXP2 causa di una
aprassia verbale infantile (MIM #602081). In questo lavoro viene analizzata una
delezione distante 3 Mb dal gene, senza interessarlo, che causa la perdita di
espressione dell’allele in cis
rispetto alla delezione, che è de novo
e di origine paterna, con espressione monoallelica da parte del solo allele
materno. Lo studio di controlli consente di precisare che FOXP2 è soggetto a
RMAE suggerendo che il fenotipo da aploinsufficienza in questo ed in altri
possibili casi è dovuto alla mancata espressione del gene in alcune cellule e non,
come si ritiene normalmente, per una sua dimezzata espressione in tutte le cellule.
Muscle connective tissue controls development of the
diaphragm and is a source of congenital diaphragmatic hernias. Nature Genetics 2015;47:496.
Il diaframma svolge la funzione respiratoria e separa il contenuto addominale
dal toracico. Funzioni svolte da una lamina muscolo-tendinea con un ampio
tendine centrale detto centro frenico dal quale originano i fasci del
muscolo che si inseriscono sullo sterno, sulle coste e sulle vertebre lombari. Per
lo sviluppo diaframmatico concorrono quindi tessuti di differente
derivazione embriologica. I difetti
diaframmatici sono malformazioni congenite frequenti (1:3.000 nati) con alta
mortalità e alti costi sanitari (>250 milioni $/anno in USA). Sono in genere
isolati con bassa ricorrenza familiare suggerendo che siano dovuti a mutazioni de novo. L’analisi molecolare ha
individuato CNV in diverse regioni genomiche con circa 50 geni candidati. Una
di queste CNV contiene un gene codificante il fattore di trascrizione, GATA4,
altamente correlato con questa malformazione (Hum Genet 2013). Ma non è chiaro
come questi geni candidati contribuiscano alla sua patogenesi. In questo studio
nel topo si dimostra che la migrazione dei fibroblasti connettivali delle
pieghe pleuorperitoneali (PPF) controlla la morfogenesi del diaframma e che
l’ablazione di Gata4 (un
allele deleto nella linea germinale, l’altro allele
(floxed) deleto specificatamente nelle PPF) è causa di difetti simili a quelli
riscontrati nell’ernia diaframmatica congenita dell’uomo. Da qui l’ipotesi che
precoci mutazioni somatiche siano la causa di questa malformazione. Ipotesi da
testare (non è difficile, ne sentiremo parlare. Buon progetto di ricerca, ndr).
ACMG guides on the
interpretation of sequence variants. Nature Reviews Genetics May 2015;16. Commento di un articolo su un argomento molto
attuale: Standards and
guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus
recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the
Association for Molecular Pathology. Genetics
in Medicine May 2015;17:405. Un aggiornamento quindi su cosa scrivere nel referto e come
interpretare le varianti di sequenza trovate analizzando un singolo gene, più
geni o l’intero genoma nel contesto clinico. Questo nell’ambito solo delle
malattie mendeliane. Varie raccomandazioni: la prima è di usare una
terminologia condivisa internazionalmente classificando le varianti nelle note 5
categorie: patogeniche, probabilmente patogeniche, di significato incerto,
probabilmente benigne e benigne.
La seconda: criteri di classificazione tra
patogeniche e benigne. Le varianti in un gene che quando mutato è causa di
malattia mendeliana vanno pesate (vedi i vari gradi di evidenza per ogni
categoria) considerando tutti i casi noti anche se la causa della malattia può
variare da caso a caso. Si vuole quindi limitare il numero di varianti da
considerare causative e per le quali vi è un’utilità clinica (actionable) a
quelle per le quali vi sia una sufficiente evidenza. Viene incoraggiato il
ricorso a database pubblici come ClinVar e Human Gene Mutation Database e
database locus-specifici.
Note di cautela nell’interpretazione dei risultati
dei programmi di previsione di patogenicità in
silico, con il suggerimento di ricorrere a più algoritmi per consentire poi
il confronto dei risultati e la raccomandazione di inserire nel referto solo
una conclusione di questo confronto.
Viene sottolineata la necessità di confermare le
varianti patogeniche o probabilmente
tali ricorrendo ad un altro metodo di sequenziamento o di analisi (di
segregazione ad es.) ed analizzando i genitori. E suggerimenti sulla gestione
clinica, come quella che una variante di significato incerto non deve
condizionare la conduzione clinica.
Infine l’aspetto fondamentale di un continuo
aggiornamento classificatorio delle varianti con una rianalisi dei risultati
ricorrendo a varie fonti cliniche e database. E un follow-up clinico dei pz
alla luce dei risultati ottenuti.
ClinGen — The Clinical Genome Resource. NEJM
2015;372:2235. Presentazione del Progetto GenClin e ClinVar
database (www.clinicalgenome.org)(www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar). Con schemi e scopi: 1: condivisione dei dati genomici e clinici con
dati forniti da clinici, ricercatori e pz e famiglie. 2: Standardizzazione dell’annotazione ed
interpretazione delle varianti. 3: Consenso evidence-based di esperti su geni e
varianti. 4: Comprensione delle variazioni nelle diverse popolazioni per
l’interpretazione dei risultati del test genetico su una scala globale. 5: Preparazione
di algoritmi per l’interpretazione delle varianti. 6: Stabilire l’applicazione
clinica di geni e varianti. 7: Predisporre e favorire il trasferimento dell’informazione
genetica nelle cartelle cliniche elettroniche. 6. Diffondere alla comunità senza
alcun vincolo le conoscenze e le risorse.
The FDA and Genomic Tests — Getting Regulation Right. NEJM 2015;372:2258. Commenti sulla decisione della FDA di fornire un regolamento
sull’applicazione clinica del NGS. Con il rischio, dice il commento, che il suo
intervento sia controproducente perché l’applicazione del NGS è ancora in
evoluzione. Quindi poche e certe regole. Perché è altamente complesso per
questa tecnica attestarne la validità analitica e la validità clinica. Per
stimare il significato clinico di nuove varianti genetiche dobbiamo sequenziare
milioni di persone (nel 2014 era stato analizzato solo parzialmente il genoma
di 228.000 persone) e conoscerne il fenotipo, non solo il motivo per cui hanno
fatto il test. E ClinGen
e ClinVar includono solo varianti di interesse non tutte quelle identificate e
in questi database non vengono versati i dati dei laboratori commerciali. Il
processo, conclude il commento, di usare il test genomico in clinica è appena
partito e continuerà per decenni e porterà indubbi benefici per la popolazione
in termini di prevenzione, cura e efficacia costo-beneficio. La posta in gioco
è alta e ci vorrà tempo per regolamentarlo.
Gene-Panel Sequencing and the Prediction of Breast-Cancer Risk. NEJM 2015;372:2243. Ricorso all’analisi genomica ed validità ed utilità clinica: di parere
diverso rispetto al commento su citato (Pg. 2258) si sostiene invece che ogni
test genomico vada offerto solo se ne è stata ben stabilità la validità
clinica. Nel lavoro vengono presentate le difficoltà di attribuire a una
variante rara un rischio sufficientemente robusto da poter essere usato nella
stima personalizzata di rischio di cancro mammario. Vengono presentati i vari
pannelli in uso per la ricerca di mutazioni dei geni del cancro mammario (Tab. 1),
la sorveglianza clinico-strumentale per mutazioni di BRCA1 e 2 (Tab. 2), il
rischio stabilito di cancro mammario per geni con mutazioni troncanti (Tab. 3),
l’impostazione della ricerca per stimare il rischio di cancro mammario
associato a varianti rare (Tab. 4).
Precision Medicine — Personalized, Problematic, and Promising. NEJM
2015;372:2229. Editoriale sulla Medicina di precisione (il termine
“personalizzata” è giustamente non condivisa da molti medici perché la medicina
è da sempre personalizzata). Definizione: trattamento mirato alle necessità del
singolo pz sulla base delle sue caratteristiche genetiche, dei biomarcatori,
fenotipiche o psicosociali che lo distinguono da altri pz che presentano le
stesse caratteristiche, con lo scopo di migliorarne l’esito clinico e ridurne
gli effetti collaterali per coloro che hanno minor probabilità di beneficiare
di uno specifico trattamento (verbosa e troppo lunga, ndr). Con esempi in cui è
stata applicata (Tab. 1) come la LMC, biomarker BCR-ABL
e terapia specifica con l’Imatinib; la malattia coronarica, biomarker CYP2C19 terapia Clopidogrel; FC biomarker G551D terapia Ivacaftor; Alcolismo biomarker GRIK1
terapia Topiramato; Amaurosi congenita Leber
biomarker RPE65 terapia genica (14 in
tutto). L’eterogeneità causale di moltissime malattie, con i diversi meccanismi
patogenetici, terapie e decorso spinge per la PM, che ora è resa praticabile con
l’identificazione di molti biomarcatori e soprattutto con lo sviluppo delle
tecniche genetiche (WES, WGS, e le varie omiche). Ma gli interesse degli attori
(pz e famiglie, personale medico, sistema sanitario, assicurazioni) tendono a
non coincidere, anzi in alcuni casi a scontrarsi. Gli scopi sono ben presentati
in Fig. 1: con una malattia causalmente etrogenea va applicato il test
diagnostico, che consente una sottoclassificazione della patologia che precisa
il probabile decorso, se la ricerca propone una nuova terapia di questa ne va
verificata l’applicabilità e l’efficacia con sperimentazioni cliniche (punto
nodale: il reclutamento deve coinvolgere persone con la stessa specifica
patologia, anche da qui la necessità di una precisa diagnosi, ndr), nuove linee
guida che vanno adottate dai pz/famiglie, dal personale sanitario e dal sistema
sanitario. Una parte considerevole della medicina di precisione è svolta
dall’informatizzazione di tutti i dati clinici “not for replacing judgment
but for providing facts”, come ad es. algoritmi per le varie attività diagnostiche,
prognostiche e terapeutiche. Occorre se si vuole avere una PM un nuovo sistema
sanitario, nuovi medici e una popolazione adeguatamente preparata. (Un’utopia?
Ma abbiamo assistito ad utopie che sono rimaste tali per 30 anni, come la
diagnosi genetica prenatale non invasiva, finché le nuove tecniche non l’hanno
resa possibile, Ndr).
Un
ottimo esempio di Medicina di precisione:
Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate
Cancer. Cell
2015;161:2015. La prognosi di pz con cancro
prostatico avanzato è infausta. In
questo lavoro collaborativo l’integrazione tra analisi di sequenza clinica (WES
e trascrittoma) di tessuto tumorale da biopsia di 150 pz ha consentito di
stabilire che la maggior parte di loro ha alterazioni molecolari che possono
indicare il trattamento opportuno in base a quanto riscontrato. Quindi la
necessità di una consulenza genetica per applicare una medicina di precisione.
MALATTIE
NEUROLOGICHE/NEURODEGENERATIVE
Loss-of-function
variants in ABCA7 confer risk of Alzheimer’s disease. Nature
Genetics 2015;47:445. La ricerca di varianti
rare che conferiscono suscettibilità all’Alzheimer nella popolazione
dell’Islanda ha individuato una variante con perdita di funzione del gene ABCA7
associata a tale patologia (OR 2.12), associazione presente in altri gruppi di
studio europei e USA con OR combinata di 2.03. Il gene è un membro della
sottofamiglia dei trasportatori ABC (ATP-binding cassette) trasportatori di lipidi attraverso la
membrana. In particolare ABCA7 promuove nelle cellule in coltura l’efflusso di
fosfolipidi e colesterolo alle apoliproteine A-I ed E. ABCA7, sempre in vitro, promuove la fagocitosi. In vivo, nel topo KO Abca7, il suo ruolo
principale sembra essere di regolare la fagocitosi. Si conclude con un buon
suggerimento: arruolare nelle sperimentazioni cliniche dell’Alzheimer portatori
di varianti con perdita di funzione di questo gene per chiarire le nostre
conoscenze sulla patogenesi e sull’effetto dei vari approcci terapeutici.
Rett
syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics
2015;16:261. Bella review sulla s.
Rett da mutazione di MECP2, proteina associata alla cromatina con diverse
funzioni che integra vari aspetti della biologia neuronale. Viene discusso come
MECP2 regola l’espressione genica di vari geni, tramite la loro attivazione,
repressione o a livello post-trascrizionale, come a sua volta sia regolata da
miRNA. Tutto questo per capire le basi molecolari della sindrome. Ricorrendo a
modelli animali (vi sono 9 diversi modelli murini di s. Rett) e valutando, dopo
23 anni di ricerca, l’intero quadro biologico e clinico che emerge dallo
spettro mutazionale del gene, vengono proposti due diversi modelli funzionali
della sindrome. La comprensione della funzione di questa “enigmatica” proteina
faciliterà l’individuazione dell’appropriata terapia.
HTRA2 p.G399S
in Parkinson disease, essential tremor, and tremulous cervical dystonia. PNAS
2015;112;E2268. Lettera relativa ad un lavoro (Mitochondrial
serine protease HTRA2 p.G399S in a kindred with essential tremor and Parkinson
disease. PNAS 2014;111:18285)(Articoli
Dicembre 2014) che riferiva di una variante del gene HTRA2 in una grossa
famiglia turca era responsabile in eterozigosi di tremore essenziale e in omozigosi
di un fenotipo più grave e più precoce. È stata cercata nella popolazione
norvegese in diversi gruppi di persone: pz con Parkinson, pz con tremore
essenziale, con distonia cervicale e popolazione di controllo. Non sono stati
trovati omozigoti e non è stata trovata una differenza significativa di
frequenza di eterozigosi di questa variante tra pz e popolazione generale.
Nella risposta gli AA sottolineano che quanto da
loro trovato riguardava la famiglia descritta e che, come avevano precisato, tale
variante non era la causa di tremore essenziale nella popolazione turca da loro
testata. Notano: che il tremore essenziale è una malattia complessa con più
geni causali, che nella loro famiglia la sintomatologia del Parkinson si è
manifestata più di 10 anni dopo il tremore, che nei pz norvegesi potrebbero
esserci altre varianti del gene HTRA2 non individuate; che la distonia
cervicale non fa parte della sintomatologia da loro indicata.
GENETICA UMANA/CLINICA
***
Genetic linkage analysis in the age of whole-genome
sequencing. Nature
Reviews Genetics 2015;16:275. L’analisi di linkage è stato l’approccio
classico per l’identificazione dei geni di suscettibilità dei caratteri
complessi, prima dell’avvento degli studi di associazione genomici (GWAS) con
l’uso di SNP.
Ma tale tecnica funziona male per le varianti rare che possono
essere responsabili di una buona proporzione di caratteri complessi. Ora con
l’applicazione del sequenziamento dell’intero genoma (WGS) l’analisi di linkage
può tornare utile per l’identificazione di geni di suscettibilità di queste
malattie. In questa review vengono esposti i principi generali delle tecniche
di linkage e suggerimenti di come applicarle sui dati ottenuti con WGS. Quindi
una tecnica che sta rinascendo ed utilissima da affiancare all’analisi genomica
soprattutto per l’identificazione di varianti rare associate a caratteri
complessi ad alta penetranza.
Pinpointing clinical diagnosis through whole exome sequencing to direct
patient care: a case of Senior-Loken syndrome. Lancet 2015;358:1916. Case report. Bambino visto nel 2002 a 2 mesi di vita per disfunzione
dei fotorecettori ed alterazioni pigmentarie retiniche (mottling) con vasi
sanguigni retinici attenuati. La diagnosi è stata di distrofia retinica precoce
non sindromica. Dopo 4 anni nata una sorella con la stessa condizione. Messi in
follow-up. Nel 2012, si è reso disponibile nel SSN UK il NGS del pannello delle
distrofie retiniche (>20 geni), ma l’analisi è risultata negativa. Nel 2013
è stato applicato WES che ha identificato una mutazione nota come causa di
malattia del gene IQCB1, che
codifica una proteina, nefrocistina, espressa nel cilio primario che è un
organello essenziale per la funzione sia dei fotorecettori retinici che
dell’epitelio renale. Mutazioni di questo gene sono responsabili di distrofie
retiniche sia sindromiche che non sindromiche, tra cui la sindrome Senior-Loken
5 (MIM #609254) con distrofia retinica ad insorgenza infantile e nefronoftisi,
una malattia cistica renale.
Questo
ha indotto il medico curante a fare indagini per la funzionalità renale dei due
bambini. Il primo, 12 anni, ha una patologia renale (stadio 4) con aumento
della creatininemia, anemia, cisti renali multiple associate a deficit di
crescita. Messo in emodialisi e poi trapiantato. La sorella, ora di 7 anni, non
ha patologia renale. Diagnosi di s. Senior-Loken, che ha consentito ai curanti di
pianificare in maniera ottimale la terapia dell’insufficienza renale e ridurre
i tempi di attesa del trapianto. WES è
servita quindi anche per un’appropriata gestione medica.
X-Linked TEX11 Mutations, Meiotic Arrest, and Azoospermia in
Infertile Men. NEJM 2015;372:2097. Il 20% di pz con azoospermia
non ostruttiva hanno un’anomalia cromosomica, per il restante 80% non c’è
diagnosi ( “idiopatica”). Di alcuni geni, che nel topo sono associati all’infertilità,
si conoscono mutazioni in pz con azoospermia (HSF2, SYCP3, PRM1,
PRM2, SOHLH1 e NR5A1). In questo lavoro l’analisi array-CGH su campione di sangue
di 15 pz ha identificato 2 pz con azoospermia e atrofia testicolare mista con una
piccola (99 kb) delezione interessante 3 esoni del gene TEX11 sul cromosoma
X(p13.1). L’analisi Sanger del gene TEX11 di 289 pz e 384 controlli ha consentito
di individuare 5 nuove mutazioni del gene (3 di splicing e 2 missenso) in 7 pz
(2.4%) e non nei controlli. Buona parte delle mutazioni sono state trovate in
pz con arresto meiotico completo (5 su 33) e solo due mutazioni in pz con azoospermia
ed atrofia testicolare mista. Non sono state invece trovate mutazioni in pz con
azoospermia e sindrome a sole cellule Sertoli. L’arresto meiotico in questi pz
è simile al fenotipo del modello murino carente di Tex11. In conclusione mutazioni di TEX11 sono una frequente causa della
infertilità maschile con arresto meiotico ed azoospermia nell’infertilità
maschile.
FDA approves
23andMe gene carrier test. Nature Biotechnology 2015;33:435. Approvato il test di screening del portatore per la s. Bloom
dopo un iter di 15 mesi La FDA aveva mandato alla compagnia 23andMe una lettera
in cui le si intimava di non fornire informazioni mediche in assenza del
permesso della commercializzazione del test. L’approvazione riguarda appunto il
test del portatore per una malattia che comporta predisposizione al cancro più
comune negli ebrei askenaziti con la ricerca della classica mutazione del gene
BLM (del di 6pb e ins 7pb), test considerato come dispositivo medico di classe
II, che secondo la nota comporta un “moderate risk, requiring some regulatory
controls, putting carrier screening tests in the same category as condoms” (!! Ndr).
Exome
sequencing links mutations in PARN and RTEL1 with familial
pulmonary fibrosis and telomere shortening. Nature Genetics 2015;47:512. Applicazione dell’analisi esomica per cercare i
fattori di rischio genetico della fibrosi familiare polmonare. La Fibrosi
polmonare idiopatica colpisce prevalentemente i maschi fumatori, è una malattia
progressiva con breve attesa di vita dopo la diagnosi. Poco note le basi
genetiche. Conosciamo varianti comuni associate che spiegano solo una piccola
parte del rischio genetico, come MUC5B e TERT
che codifica una proteina (trascrittasi inversa telomerica) componente
della telomerasi. Nel 15% dei casi familiari si trovano mutazioni rare di TERT
con trasmissione AD a penetranza incompleta. Meno frequentemente si trovano
mutazioni rare di un gene codificante una molecola di RNA (TERC), del gene Discherina
(DKC1)(le mutazioni di questo gene causano la Discheratosi congenita) e
proteine del surfattante EFTPC e SFTPA2. In questo lavoro con l’analisi esomica
di pz con Fibrosi polmonare familiare da causa non nota, usando anche un ampio
campione di controllo, sono state trovate mutazioni dannose in eterozigosi e
solo nei pz (7 probandi) del gene PARN, una esoribonucleasi non nota per avere
un ruolo nella biologia dei telomeri, con mutazione presente in tutti gli
affetti della famiglia. Sono state
trovate poi in 5 pz mutazioni (2 con perdita di funzione e 3 missenso in sede
altamente conservata) di un altro gene, RTEL1,
la cui proteina contiene un dominio N-terminale elicasico che protegge il
telomero durante la replicazione. I portatori di mutazione PARN o ETEL1 hanno
telomeri dei leucociti più corti. Ma anche i familiari, che non hanno ereditato
la mutazione, hanno telomeri più corti, ma comunque più lunghi rispetto ai pz
che portano la mutazione, dato interpretato come eredità epigenetica della
lunghezza telomerica. In sintesi i risultati ottenuti ci dicono che questi due geni
sono mutati in circa il 7% dei pz con Fibrosi polmonare idiopatica e che vi è
un legame tra questa patologia e la disfunzione telomerica.
Biallelic
mutations in SNX14 cause a syndromic form of cerebellar atrophy and
lysosome-autophagosome dysfunction. Nature Genetics 2015;47:528. Le atassie in età pediatrica si presentano in
genere con ritardo di sviluppo intellettivo e atrofia cerebellare. In questa
breve comunicazione si descrive una nuova condizione riconoscibile clinicamente
a trasmissione autosomica recessiva in 12 famiglie con pz con atrofia
cerebellare, deficit cognitivo, dismorfismi facciali (tratti grossolani del
viso) da mutazioni troncanti del gene SNX14, che codifica un membro della
famiglia sortin nexin, coinvolta nel traffico intracellulare. Il prodotto del
gene si localizza nei lisosomi ed è associato con il fosfatidilinositolo 3,5
bifosfato, importante componente degli endosomi/lisosomi. In vitro le cellule derivate dai pz mostrano un ingorgo lisosomiale
e una ridotta clearance autofagica dopo induzione autofagica da digiuno. Nel
modello di zebrafish per snx14 vi è una drammatica perdita di parenchima
cerebellare, accumulo di autofagosomi e attivazione dell’apoptosi. Questa nuova
sindrome atassica da mutazione biallelica di SNX1 ha quindi come meccanismo
patogenetico una disfunzione lisosomica-autofagosomica.
A
recombined allele of the lipase gene CEL and its pseudogene CELP confers
susceptibility to chronic pancreatitis. Nature Genetics 2015;47:518. Un allele ricombinante del gene della carbossilesterasi
lipasi (CEL) e del suo pseudogene CELP determina una suscettibilità alla
pancreatite cronica, con un rischio 5 volte superiore. Tale ibrido codifica una
proteina con ridotta attività lipolitica e considerevole accumulo
intracellulare e induzione all’autofagia. Un nuovo pathway quindi diverso dal
sistema proteasi-antiproteasi delle cellule acinari del pancreas della
pancreatite cronica.
Missense
mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of
coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. PNAS 2015;112:6206. La molecola di interazione stromale 1 (STIM) è un
importante attivatore del canale del calcio ORAI1 che media il passaggio di
calcio in molti tipi di cellule. Mutazioni di STIM1 (MIM#612733) o di ORAI1
(MIM #612782) causano una grave sindrome di immunodeficienza autosomica
recessiva (rispettivamente IMD9 e IMD10). In questo lavoro si dimostra che una
mutazione di STIM1 (R429C) causa della sindrome determina un’incapacità di
attivazione di ORAI1, chiarendo quindi il meccanismo molecolare della funzione
del gene. La mutazione altera l’integrità strutturale dell’interazione
proteina-proteina di STIM1 impedendone la multimerizzazione e il legame con
ORAI1. Possibile
target terapeutico.
Oncogenic and
RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of
the effector-binding site. PNAS 2015;112:6625.
Mutazioni del gene KRAS presenti in alcuni tumori (pancreas, colon, polmone)
hanno un significato prognostico sfavorevole. Mutazioni germinali del gene sono
causa della sindrome Noonan. E’ un attraente target terapeutico anche se il
ricorso a suoi inibitori non ha dato i risultati sperati. Buona parte delle
mutazioni causa di malattia incrementano la forma di KRAS attivata legata a
GTP, ma di altre non ne conosciamo l’effetto. In questo lavoro viene
individuato un nuovo meccanismo di acquisizione di funzione di alcune mutazioni
della s. Noonan, responsabili dell’attivazione del segnale KRAS. Quindi nuove
possibili strategie terapeutiche per il cancro con bersaglio il meccanismo
oncogenico del gene tramite interazioni autoinibitorie con le membrane
cellulari.
Reversal of
mitochondrial defects with CSB-dependent serine protease inhibitors in patient
cells of the progeroid Cockayne syndrome. PNAS 2015;112:E2910. La s. Cockayne (CS) è una rara malattia genetica con
fotosensibilità, grave compromissione neurologica e di sviluppo e
invecchiamento precocissimo con ipersensibilità allo stress ossidativo. Clinicamente
si riconoscono 3 sottotipi: la CS I ad inizio nella prima infanzia, la CS II ad
inizio precocissimo con segni a comparsa in epoca prenatale e la CS III con
segni più lieve e ad inizio nella terza infanzia. Nel 70% dei casi la mutazione
è a carico del gene CSB, nel 30% del gene CSA, le loro proteine sono coinvolte
nel meccanismo di escissione nucleotidica (NER
-Nucleotide Excision Repair) dei danni da raggi UV. Ma non si conosce come il
grave fenotipico della CS si possa basare solo sul difetto di riparazione
trascrizionale. Nel lavoro viene identificato un nuovo pathway coinvolto nelle
cellule di pz con CS. In particolare CSB sregola l’espressione della serin
proteasi che degrada la DNA polimerasi gamma mitocondriale ed altera la
funzione mitocondriale. Tale effetto può essere normalizzato, sempre in vitro, ricorrendo
a due diverse strategie. Possibili terapie per una malattia per la quale non c’è
alcuna possibilità terapeutica.
RASopathic”
astrocytes constrain neural plasticity. Science 2015;348:636. Commento di un lavoro (Dysregulation
of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Sci Transl Med May 2015;
6;7(286):286ra66) sulla miglior comprensione dei
meccanismi patogenetici nella s. Costello (#218040), una RASopatia con ritardo
di sviluppo, anomalie cranio-facciali, malformazioni cardiovascolari e deficit
cognitivo, deficit che sembra legato ad un’anomalo sviluppo degli astrociti, che
sono cellule cerebrali non neuronali. Gli astrociti derivati (iPSC
) da pz Costello con la mutazione HRASG12S hanno una differenziazione
prematura, un’aumentata proliferazione e sono di dimensioni maggiori del normale
(Fig. 1). Il trattamento delle iPSC Costello con un inibitore della farnesil transferasi
(RAS per la sua funzione nella cascata trasduzionale deve essere associato
fisicamente alla superficie interna della membrana plasmatica tramite modifiche
strutturali e il primo passo è la farnesilazione) (https://www.google.it/?gws_rd=ssl#q=farnesil+transferasi)
riduce negli astrociti l’espressione di vari proteoglicani. Si è osservato che
i topi, in cui HRAS mutato era espresso selettivamente negli astrociti, esprimono
più componenti della matrice extracellulare con la formazione di una rete
perineuronale intorno agli interneuroni, accelerandone la maturazione ed
interferendo con il periodo critico della plasticità neuronale. In conclusione
gli astrociti portatori della mutazione durante lo sviluppo sregolano la maturazione
corticale. Un possibile target terapeutico per normalizzare la neuroplasticità
e prevenire il deficit cognitivo.
Interessante nel commento l’osservazione
che mentre gli astrociti nella s. Rett e nella s. Down hanno un effetto
inibitorio sulla crescita dei neuroni che stanno sviluppandosi, quelli di HRASG12S
invece secernono potenti fattori che promuovono l’eccesso di crescita neuronale
e lo sviluppo sinaptico.
BIOLOGIA
Rap and chirp about X inactivation. Nature
2015;521:170. Commento
del lavoro sullo stesso fascicolo (The
Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence
transcription through HDAC3) con
sottotitolo: Two new techniques
identify proteins that directly interact with a non-protein-coding RNA called Xist
to mediate inactivation of one X chromosome in female mammals. Queste due
nuove tecniche sono: RNA antisense purification–mass spectrometry
(RAP–MS) e Comprehensive identification of RNA-binding proteins by mass
spectrometry (ChIRP–MS) usate per identificare le proteine interagenti in vivo con Xist. Con
la prima tecnica identificate 81 proteine, con la seconda 10, di cui 9 in comune
con la prima.
Il commento fa notare che conosciamo
più di 10.000 lncRNA (long non-coding RNA), della maggior parte sappiamo molto
poco della loro funzione. E queste due tecniche consentiranno di individuarne i
vari pathway in cui agiscono.
GTEx detects genetic effects. Science 348:640. The
genetic basis for variation among individuals
in
transcript abundance across tissues is analyzed. Serie di
articoli (Pg. 648, 660, 666) sul trascrittoma nell’ambito del Genotype-Tissue
Expression (GTEx) Consortium. Sappiamo che gran parte dei comuni polimorfismi
genetici associati ad un rischio di malattia agiscono modulando l’espressione genica,
poco sappiamo di come questo avvenga. Quello che sappiamo del trascrittoma
deriva da studi su poche linee
cellulari. Il Cosorzio GTEx si è
proposto di associare all’analisi WGS il sequenziamento di RNA di più di 50
tessuti post-mortem di 1.000 donatori.
Malaria
continues to select for sickle cell trait in Central Africa. PNAS
2015;112:7051. La Falcemia è la principale cause di
morte infantile nel continente africano, dove si collocano circa l’85% dei pz, e
sta diffondendosi per le importanti migrazioni in altri continenti. E’
prevedibile che avrà un impatto sanitario considerevole globale nel prossimo
futuro. La sua prevalenza è più del 15% in gran parte dell’Africa centrale e
raggiunge il 28% in Gabon, dove 1-2% dei nati è affetto da questa malattia. E’
allora utile conoscere perché tale malattia genetica mantiene la sua frequenza
nella popolazione umana. Questo nonostante gli omozigoti in genere non si
riproducono. Sappiamo che l’alta frequenza della Falcemia è associata alla
malaria con un meccanismo ancora poco noto di protezione dalla malattia
parassitaria grave.
Mancano
studi epidemiologici aggiornati su questa associazione. Lo scopo di questo
studio epidemiologico di una coorte di 3.958 adulti di 17.80 anni nella
repubblica del Gabon (piccola popolazione, abbondanti risorse naturali e
investimenti stranieri hanno aiutato a rendere il Gabon una delle nazioni più
prospere della regione e del continente nero, wiki) è di verificare la
relazione tra malaria e prevalenza della malattia in un paese con una
popolazione sufficientemente grande e nello stesso tempo con stili di vita e
ambiente piuttosto uniforme. In questo campione il 21.7% ha il genotipo HbAS,
nessuno il genotipo HbSS confermando l’alta mortalità infantile per la
condizione di omozigosi. Il 52% era positivo per il citocromo b del plasmodio .
Nel 28% non è stato possibile determinare la specie, i rimanenti 1.489 (93.1%)
avevano avuto l’infestazione del P. falciparum,
il 21.9% del P. malariae, il 2.1% del P. ovale. Il principale risultato di questo
studio, che a differenza dei precedenti si basa non sulla presenza della
malattia ma in buona parte sull’infestazione malarica asintomatica, è la
conferma che vi sia una forte associazione tra P. Falciparum e prevalenza di
Falcemia.
***
A forward
genetic screen identifies erythrocyte CD55 as essential for Plasmodium
falciparum invasion. Science 2015;348:711.
Nell’infestazione malarica i parassiti invadono e si riproducono nei globuli
rossi umani. Si sa da studi epidemiologici che esiste una polimorfismo
eritrocitario che conferisce resistenza alla malaria severa. Gli studi genetici
(GWAS) per la ricerca di tali determinanti sono ostacolati dal fatto che gli
eritrociti mancano del nucleo. Sono state usati GR derivati da cellule
staminali ematopoietiche per applicare uno screening genetico e per individuare
i determinanti dell’ospite del Plasmodium
falciparum, ricorrendo ad una complessa procedura in vitro. Ed è stato individuato CD55 come un fattore essenziale
per l’invasione del parassita. CD55 è una proteina che protegge le cellule
dalla lisi da parte del complemento e nelle cellule epiteliali è un recettore
di patogeni batterici e virali. Eritrociti CD55 nulli sono refrattari all’invasione
perché il parassita non può ancorarsi efficacemente alla membrana eritrocitaria.
Tale effetto protettivo non è invece svolto nei confronti del P. knowlesi. Sono stati individuati due
polimorfismi di CD55 presenti in significativa maggior frequenza in persone con
esposizione ancestrale alla malaria, presenti solo in discendenti di africani.
Altro dato interessante: vi sono persone ematologicamente normali che mancano
completamente di CD55. Tutto questo fa pensare che CD55 possa essere un buon target
per la terapia malarica, malattia frequente, endemica e importante causa di
mortalità infantile.
***
A CRISPR
Connection between Chromatin Topology and Genetic Disorders. Cell
2015;161:955. Sono comuni e variazioni strutturali nel genoma umano, ma non è semplice interpretarne
la patogenicità. Sappiamo che tipicamente le variazioni strutturali con CNV
agiscono tramite modificazioni di dosaggio di uno o più geni. Ma vi sono altri
meccanismi come quello prospettato dal commento su citato di un articolo sullo
stesso fascicolo (Disruptions of
Topological Chromatin Domains Cause Pathogenic Rewiring of Gene-Enhancer
Interactions. Pg. 1012)(un italiano tra gli AA), in cui si dimostra che
alcune varianti strutturali possono interrompere la topologia cromatinica causando
interazione ectopiche enhancer (intensificatore)-promotore, alterata espressione
genica spazio-temporale e malformazioni (ne vengono portati 3 esempi). Da studi
recenti sappiamo che l’organizzazione cromatinica è caratterizzata da domini
topologicamente associati (TAD) che suddividono ogni cromosoma interfasico in
segmenti di megabasi che hanno interazioni frequenti all’interno del dominio, e
poche all’esterno. Da altri studi sappiamo che alterazioni strutturali alla
periferia di TAD alterano l’espressione genica in vitro e in vivo. Da questo
lavoro risulta che questo avviene anche per alcune malformazioni nell’uomo,
come quelle degli arti, alterazioni strutturali che interessano la struttura del
TAD che comprende il locus NT6/IHH/EPHA4/PAX3. Alterazioni che sono state
riprodotte nel topo ricorrendo alla tecnica del genome editing CRISPR. Nei
fibroblasti di pz e nel tessuto degli arti dei modelli murini le alterazioni
strutturali causano interazione ectopiche tra promotori e DNA non codificante. Questo
dimostra l’importanza funzionale dei TAD nell’orchestrare l’espressione genica
tramite l’architettura genomica e indica i criteri per prevedere la
patogenicità delle varianti strutturali, in particolare modo nelle regioni non
codificanti.
GENOME
EDITING
Raccolta
di articoli di regolamentazione, di etica e di tecnica sul Genome editing sullo
stesso fascicolo di Nat Biotech.
Next-generation
genome editing. Nature Biotechnology 2015;33:429. Sottotitolo: Recent calls for
public engagement concerning the risks and benefits of genome editing in the
human germline, particularly given our poor knowledge of what we should change
in the human genome.
Oversight of human
inheritable genome modification. Nature Biotechnology. Pg. 454 (letter). Raccomandazione di uno
scambio di opinioni tra vari rappresentati politici e tecnici di ogni nazione,
altrimenti si rischia un ‘dialogue of the deaf ’,
cioè un processo unilaterale in cui i partecipanti non rispondono al punto di
vista degli altri, impedendo così di adottare un’ideale politica comune. E’
tempo quindi di riportare l’argomento alla discussione all’ONU
CRISPR
germline engineering—the community. Nature Biotechnology. Pg. 478.
L’editore ha chiesto ad alcuni membri della comunità scientifica internazionale
di commentare gli aspetti etici sollevati dalla possibilità di applicare il
genome editing sulle cellule germinali umane. Sommario delle risposte di 26
(per esteso nel Supplementary comments)(tra cui JC Venter e l’unico italiano
Luigi Naldini del San Raffaele di MI). Interessante la figura con le varie
tappe: dall’autorizzazione della corte suprema US per la sterilizzazione non
volontaria delle donne nel 1927 (i nazisti vengono dopo nel 1933), all’Aprile
2015 quando è stato pubblicato il primo lavoro (rivista online Beijing-based Protein & Cell, Springer) che annuncia la modificazione di
geni in zigoti umani tramite CRISP (vedi Spigolature Aprile 2015).
Recent patent
applications in genome editing. Nature Biotechnology. Pg. 489. Elenco delle domande di brevetto. Sono 10, tra cui una per
la FC.
Epigenome editing by a
CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and
enhancers. Pg. 510. Tecnica che consente la
manipolazione specifica di marcatori epigenetici per un preciso controllo del
fenotipo cellulare o per conoscere la relazione tra epigenoma e controllo
trascrizionale.
Increasing the
efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of
nonhomologous end joining. Pg. 538.
Increasing the
efficiency of homology-directed repairm for CRISPR-Cas9-induced precise gene
editing in mammalian cells. Pg. 543.
La storia del genome editing con CRISPR. Core
Concept: CRISPR gene editing. PNAS
2015;112:6245
High-throughput
functional genomics using CRISPR–Cas9. Nature Reviews Genetics 2015;16:299. Review su questa tecnica rivoluzionaria in cui
si discutono gli aspetti pratici di esecuzione, la si confronta con la tecnica RNAi
e si prospettano future applicazioni.
Breaking Mendelian
inheritance with CRISPR–Cas. Nature Reviews Genetics May 2015;16. In genetica talora è
utile trasformare una mutazione allo stato eterozigote ad omozigote per
verificarne l’effetto fenotipico in vitro
o in vivo. Il commento presenta una tecnica che lo
consente verificata nella drosofila (The mutagenic chain reaction: A method
for converting heterozygous to homozygous mutations. Science 2015;348:442).Questa conversione è stata ottenuta nella gran parte di
cellule somatiche e germinali dell’animale e potrebbe avere un’applicazione in
vari organismi, come quelli degli insetti per il controllo dell’infestazione
malarica o della febbre dengue, anche se non va dimenticato il rischio di
diffondere organismi così modificati nell’ambiente.
UK
scientists reject call for moratorium on gene editing. BMJ 2015;350:h2601.Viene
riferito quanto commentato in una riunione a Londra dello scorso 21 Maggio
sulla moratoria per il genome editing. Sono contrari perché bloccherebbe la
ricerca. E’ stato commentato l’esperimento in Cina di applicazione del genome
editing in embrioni umani non vitali, e un partecipante riferisce che si è
sentito “not
uncomfortable”. Un ginecologo suggerisce che nell’uomo è più
opportuno, invece di correggere, scegliere l’embrione senza mutazione mediante la
diagnosi preimpianto.
A proposito
di NIPT:
The
promise of non-invasive prenatal testing needs to be monitored scientifically. BMJ 2015;350:h2518. Lettera di AA
italiani relativa all’articolo Realising the promise of non-invasive
prenatal testing. BMJ 2015;358:h1792 che sottolineano la necessità di una
verifica accurata prima di proporre NIPT come test di screening genetico per
tutte le gravidanze e per quali condizioni.
MODELLI ANIMALI
E NUOVE TERAPIE
Global genetic
analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature
2015;521:520. Le malformazioni cardiache (CHD) sono i più frequenti
difetti congeniti (1% dei nati) con frequenza oltre dieci volte superiore in
epoca fetale. La loro base genetica è suggerita dal fatto che sono presenti in
molte anomalie cromosomiche e dal loro rischio di ricorrenza. In questo lavoro
sono stati utilizzati ceppi di topo C57BL/6J,
che è quello più comunemente utilizzato in ricerca, mutagenizzati con
etilnitrosourea, incrociati tra loro per identificare le mutazioni recessive
causa di CHD. L’analisi fenotipica è stata eseguita con l’ecocardiografia e poi
indagata con CT/MRI e con valutazione macro- e microscopica. Il 30% delle linee
mutanti hanno una CHD complessa con eterotassia e spesso muoiono in epoca
prenatale. Analogamente nell’uomo il 16% di feti con CHD complessa ha
eterotassia con mortalità intrauterina elevata (30-60%). Nei topi mutanti DORV (ventricolo
ds a doppia uscita) e AVSD (difetto atrio-ventricolare) sono frequenti e con
alta mortalità prenatale, come avviene anche nella nostra specie. L’analisi
genotipica nei mutanti con CHD è stata condotta con il sequenziamento esomico.
Sono state considerate mutazioni causali quelle in omozigosi in mutanti con lo
stesso fenotipo, mentre per la situazione di omozigosi diverse ci si è basati
sull’analisi di segregazione e/o su quanto risulta dai database dei topi
KO/mutanti.
In 2.651 linee mutanti sono state
trovate 218 con CHD. L’analisi genetica ha individuato 91 mutazioni patogene di
61 geni, di cui 27 non noti come causa, se mutati, di CHD. Di questi geni 34 sono
correlati con il sistema ciliare (le cilia,
protuberanze di cellule cigliate, sono come antenne che hanno un ruolo importante
nella percezione dei dintorni cellulari e di trasduzione del segnale) e
23 nella linea mutante con difetto di lateralità. Di questi 34 geni, 16 sono
coinvolti nella trasduzione di segnale ciliare e 10 nella regolazione del
traffico vescicolare, pathway importante per la ciliogenesi e per il segnale cellulare.
Interessante, per future ricerche, che molti geni CHD codificano per proteine
interagenti, questo suggerisce il ruolo del network dell’interattoma proteico
nella patogenesi delle CHD. Il fatto che i pathway del CHD nel topi sono in
buona sovrapposizione con i geni causativi di CHD nell’uomo suggerisce che tali
pathway possono chiarire molti aspetti della complessa genetica della CHD
nell’uomo.
An RNAi therapeutic targeting antithrombin to
rebalance the coagulation system and promote hemostasis in hemophilia. Nature Medicine 2015;21:492.
La terapia sostitutiva con il fattore coagulativo relativo nell’emofilia A o B non
è sempre risolutiva soprattutto per coloro che sviluppano anticorpi inibitori.
Quindi si cercano nuovi approcci terapeutici. Sfruttando l’osservazione che la
presenza di mutazioni protrombotiche nei pz con emofilia ne migliora il
fenotipo clinico si è voluto verificare se il ricorso al meccanismo
dell’interferenza del’RNA (RNAi)(ALN-AT3)
diretto verso l’antitrombina (AT) possa mitigare l’effetto della
mutazione emofilica A nel topo e nei primati non umani. Il trattamento con
ALNN-T3 promuove l’emostasi nel modello murino di emofilia e migliora la
produzione di trombina nel modello di scimmia con emofilia A da inibitori
anti-fattore VIII. E’ in corso una sperimentazione clinica in fase 1 con questo
metodo per l’Emofilia a e per l’Emofilia B.
